Genaktivität im Reagenzglas

14.10.2022

Bei der Suche nach den Ursachen von Krankheiten und der Entwicklung neuer Therapien ist ein exaktes Verständnis der genetischen Grundlagen von zentraler Bedeutung. Würzburger Forscher haben dafür ein neues Verfahren entwickelt.

Ribosomen sind die „Proteinfabriken“ der Zelle; an ihnen findet die Translation statt – die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz eines Proteins. (Bild: Ozgu Arslan / iStockphoto.com)

Krankhafte Prozesse zeichnen sich in der Regel durch eine veränderte Genaktivität in den betroffenen Zellen aus. Ein exaktes Bild der Genaktivität kann deshalb den Schlüssel liefern für die Entwicklung neuer, zielgerichteter Therapien. Ob diese Therapien so arbeiten wie gewünscht: Auch das lässt sich mit einem Blick auf Gene und die von ihnen angestoßenen Prozesse kontrollieren.

Kein Wunder, dass Methoden und Verfahren, die detaillierte Auskünfte über die genetische Aktivität einzelner Zellen liefern, im Mittelpunkt der Forschung stehen. Ein Forschungsteam der Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) hat jetzt ein Verfahren entwickelt, das die bisherigen Methoden deutlich verbessert. Daran beteiligt waren Wissenschaftler des Instituts für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) und des Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI). Die Ergebnisse ihrer Arbeit stellen sie in der aktuellen Ausgabe der Fachzeitschrift Nucleic Acids Research vor.

Analyse eines synthetischen Transkriptoms

„Wir haben ein Verfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, die Translationslandschaft eines vollständig anpassbaren synthetischen Transkriptoms, das heißt: außerhalb der Zelle, zu analysieren“, erläutert Jörg Vogel das zentrale Ergebnis der Studie. Vogel leitet das Institut für Molekulare Infektionsbiologie der JMU und ist zudem Direktor des HIRI sowie Hauptautor der Studie. INRI-seq lautet der wissenschaftliche Name der neuen Technik – eine Kurzform von in vitro Ribo-seq.

Transkriptom: Darunter ist die Gesamtheit aller Gene zu verstehen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle aktiv sind. Es besteht aus der Summe der vorhandenen mRNA – den Transporteuren der Baupläne für Proteine aus dem Zellkern hin zu den Ribosomen. Ribosomen sind die „Proteinfabriken“ der Zelle; an ihnen findet die Translation statt – die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz eines Proteins.

Weiterentwicklung vergleichbarer Methoden

INRI-seq ist im Prinzip eine Weiterentwicklung vergleichbarer Methoden, die das gleiche Ziel verfolgen, aber weniger exakte Ergebnisse liefern oder andere Nachteile besitzen. So ermittelt beispielsweise die sogenannte RNA-Sequenzierung (RNA-seq) die Konzentration von mRNA in Zellen und lässt damit Rückschlüsse auf die jeweils aktiven Gene zu. Allerdings korreliert die endgültige Proteinhäufigkeit nicht immer mit den jeweiligen mRNA-Konzentrationen.

Genauer arbeitet die Ribosomen-Profilierung (Ribo-seq), die sich in den vergangenen zehn Jahren zu einer der wichtigsten Methoden entwickelt hat, um die Proteinsynthese direkt und transkriptomweit zu messen. „Die Ribo-seq-Methode hat die Erforschung von translatorischen Prozessen zwar erheblich vorangebracht, ist aber ebenfalls nicht ohne Einschränkungen“, sagt Jörg Vogel.

Zahlreiche Einschränkungen bei Ribo-seq

Beispielsweise sei es eine große Herausforderung, Gene mit geringer Aktivität mit Ribo-seq zu detektieren, sodass viele Gene in den üblichen Studiendesigns nicht erfasst werden. Auch die Ribo-seq-Untersuchung von Mikroben aus wichtigen ökologischen Lebensräumen wie beispielsweise dem menschlichen Darm sei schwierig, da viele von ihnen nicht im Labor kultiviert werden können.

Ein weiterer Mangel: „Auf mechanistischer Ebene können Ribo-seq-basierte Studien an Molekülen, die die Translation beeinflussen, wie beispielsweise spezielle Antibiotika, durch zelluläre Reaktionen behindert werden“, erklärt Vogel. Da Ribo-seq an lebenden Zellen durchgeführt wird, könne es somit schwierig sein, direkte und indirekte Auswirkungen auf die Translation zu unterscheiden.

Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, haben die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler aus Würzburg INRI-seq für die globale Untersuchung der Translation in einer zellfreien Umgebung entwickelt. INRI-seq arbeitet mit einem kommerziell erhältlichen in vitro-Translationssystem in Kombination mit einem in vitro synthetisierten, vollständig anpassbaren Transkriptom, das eine bessere Kontrolle der einzelnen mRNA-Spiegel erlaubt.

„Mit INRI-seq ist es beispielsweise nicht mehr erforderlich, dass translationsmodulierende Substanzen die Zellmembranen durchdringen und Ribosomen aus einer großen Anzahl lebender Zellen extrahiert werden“, schildert Vogel die Vorteile des Verfahrens. „Man braucht auch viel weniger an der oft teuren Substanz die man untersuchen will, zum Beispiel ein neues Antibiotikum das nur in kleinem Maßstab hergestellt werden kann. INRI-seq spart also auch Kosten und Zeit.“

Höhere Trefferquote im Experiment

Wie gut das System funktioniert, hat das Forschungsteam an einem synthetisch erzeugten Transkriptom des Bakteriums Escherichia coli demonstriert. Im Vergleich zu einer technisch vergleichbaren Studie an lebenden Zellen identifizierte INRI-seq fast viermal mehr Stellen, an denen Translationsprozesse starten – ein Beweis für seine hohe Sensitivität.

Dementsprechend ist für Vogel und sein Team klar: „INRI-seq hat großes Potenzial als eine alternative Methode zur Untersuchung von Translationsprozessen und damit auch von Substanzen, die diese Prozesse beeinflussen können.“

Publikation

INRI-seq enables global cell-free analysis of translation initiation and off-target effects of antisense inhibitors. Jens Hör, Jakob Jung, Svetlana Ðurica-Mitić, Lars Barquist & Jörg Vogel. 2022 Nucleic Acids Research, DOI: 10.1093/nar/gkac838