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Wie Photoblueing die Mikroskopie stört

26.02.2021

Bei der hochauflösenden Fluoreszenz-Mikroskopie kann ein unerwünschter Effekt auftreten, das Photoblueing. Wie man ihn verhindern oder für die Forschung nutzbar machen kann, zeigt eine neue Publikation in „Nature Methods“.

Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit den Cyaninfarbstoffen Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) sowie mit Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) beschichtet wurden, nach Lichtanregung bei 568 Nanometer (nm). Durch Anregung der rot-absorbierenden Farbstoffe bei 640 nm in bestimmten Bereichen (Negativbilder rechts oben) werden dort Farbstoffe photokonvertiert und es gelingt, Buchstaben auf die Oberfläche zu schreiben, die bei 568 nm angeregt wurden und bei etwa 580 nm fluoreszieren. Der Carborhodaminfarbstoff zeigt ein effizienteres Photobluing als die Cyaninfarbstoffe.
Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit den Cyaninfarbstoffen Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) sowie mit Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) beschichtet wurden, nach Lichtanregung bei 568 Nanometer (nm). Durch Anregung der rot-absorbierenden Farbstoffe bei 640 nm in bestimmten Bereichen (Negativbilder rechts oben) werden dort Farbstoffe photokonvertiert und es gelingt, Buchstaben auf die Oberfläche zu schreiben, die bei 568 nm angeregt wurden und bei etwa 580 nm fluoreszieren. Der Carborhodaminfarbstoff zeigt ein effizienteres Photobluing als die Cyaninfarbstoffe. (Bild: Team Markus Sauer / Universität Würzburg)

Neueste Entwicklungen der Fluoreszenzmikroskopie erlauben es, einzelne Moleküle in Zellen oder Molekülkomplexen mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 20 Nanometer abzubilden. Dabei tritt aber unter Umständen ein Effekt auf, der die Ergebnisse verfälscht: Das verwendete Laserlicht kann in der Probe sehr reaktive Sauerstoffmoleküle entstehen lassen. Diese können dann die eingesetzten Fluoreszenz-Farbstoffe so stark beschädigen, dass sie nicht mehr fluoreszieren. Unter Mikroskopie-Fachleuten ist dieser Effekt unter dem Namen Photobleaching bekannt.

Verschiedene Fluoreszenz-Farbstoffe können durch Photobleaching aber auch so umgewandelt werden, dass sie Licht von kürzerer Wellenlänge absorbieren. „Ein zuvor rot fluoreszierender Farbstoff leuchtet dann grün. Seine Fluoreszenz wurde auf der Wellenlängenskala zum blauen Bereich hin verschoben. Daher heißt dieser Effekt Photoblueing“, erklärt Professor Markus Sauer, Experte für superauflösende Mikroskopie vom Biozentrum der Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU).

Erste exakte Beschreibung des Photoblueing

Sauers Team präsentiert nun im Journal Nature Methods erstmals den exakten molekularen Mechanismus des Photoblueing für Cyaninfarbstoffe wie Cy5. An der Publikation beteiligt ist auch Dr. Martin Schnermann vom Center for Cancer Research in Frederick (USA).

„Weil wir den Mechanismus so exakt verstanden haben, gelang es uns, das Photoblueing durch einfache Zusätze wie Vitamin C zu verhindern oder es durch die Zugabe einer Art Katalysator zu erhöhen“, sagt Markus Sauer.

Das Photoblueing zu unterbinden, kann durchaus wichtig sein. Der Effekt kann zwar nur wenige Prozent des eingesetzten Farbstoffs betreffen, trotzdem aber zu Fehlern oder Fehlinterpretationen der Mikroskopie führen, zum Beispiel bei Energietransferexperimenten (FRET). Das liegt daran, dass die umgewandelten Farbstoffe ebenso hochempfindlich detektiert werden wie die Ausgangsprodukte.

Einfache Puffer verhindern das Photoblueing

„Unsere Ergebnisse zeigen, welche Farbstoffe davon betroffen sind und wie man das Photoblueing durch einfache Pufferzusätze verhindern kann“, fasst Sauer die Inhalte des Nature-Methods-Papers zusammen. „Sie zeigen aber ebenso, wie man das Photoblueing eventuell vorteilhaft für die Fluoreszenzbildgebung und für die Verfolgung von einzelnen, gezielt umgewandelten Farbstoffmolekülen einsetzen kann.“

Genau das will Sauers Team als nächstes angehen: Das Photoblueing soll unter anderem für die gezielte Verfolgung einzelner bakterieller und viraler Partikel bei Infektionsprozessen weiterentwickelt werden. Die hier beschriebenen Arbeiten wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG gefördert.

Publikation

Photoblueing of organic dyes can cause artifacts in super-resolution microscopy. Dominic A. Helmerich, Gerti Beliu, Siddharth S. Matikonda, Martin J. Schnermann, Markus Sauer. Nature Methods, 25. Februar 2021, https://doi.org/10.1038/s41592-021-01061-2

Kontakt

Prof. Dr. Markus Sauer, Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik, Universität Würzburg, T +49 931 31-88687, m.sauer@uni-wuerzburg.de

Weitere Bilder

Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit den Cyaninfarbstoffen Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) sowie mit Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) beschichtet wurden, nach Lichtanregung bei 568 Nanometer (nm). Durch Anregung der rot-absorbierenden Farbstoffe bei 640 nm in bestimmten Bereichen (Negativbilder rechts oben) werden dort Farbstoffe photokonvertiert und es gelingt, Buchstaben auf die Oberfläche zu schreiben, die bei 568 nm angeregt wurden und bei etwa 580 nm fluoreszieren. Der Carborhodaminfarbstoff zeigt ein effizienteres Photobluing als die Cyaninfarbstoffe.
Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit den Cyaninfarbstoffen Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) sowie mit Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) beschichtet wurden, nach Lichtanregung bei 568 Nanometer (nm). Durch Anregung der rot-absorbierenden Farbstoffe bei 640 nm in bestimmten Bereichen (Negativbilder rechts oben) werden dort Farbstoffe photokonvertiert und es gelingt, Buchstaben auf die Oberfläche zu schreiben, die bei 568 nm angeregt wurden und bei etwa 580 nm fluoreszieren. Der Carborhodaminfarbstoff zeigt ein effizienteres Photobluing als die Cyaninfarbstoffe. (Bild: Team Markus Sauer / Universität Würzburg)

Von Robert Emmerich

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